论文范文:黄甘控油洗剂制备工艺及联合除湿固发汤治疗 雄激素性秃发(湿热

来源: 未知 作者:paper 发布时间: 2022-07-09 11:00
论文地区:中国 论文语言:中文 论文类型:管理论文
目的:研究制备黄甘控油洗剂工艺,确定其提取、成型工艺,奠定院内制剂 开发基础。 方法:以挥发油得率为评价指标,采用单因素实验法优选侧柏叶、艾叶和薄 荷的芳香水制备工
目的:研究制备黄甘控油洗剂工艺,确定其提取、成型工艺,奠定院内制剂
开发基础。
方法:以挥发油得率为评价指标,采用单因素实验法优选侧柏叶、艾叶和薄
荷的芳香水制备工艺;选择君药中侧柏叶(槲皮苷)、甘草(甘草酸铵、甘草苷)、
黄柏(盐酸小檗碱)和臣药蛇床子(蛇床子素)的含量和干膏率作为综合评价指
标,采用正交实验法确定最佳水提取工艺;以槲皮苷等上述指标成份含量、澄清
度和微生物限度为评价指标,采用单因素实验法优选浓缩纯化工艺和成型工艺。
结果:在 8 倍水量下,水蒸馏提取侧柏叶、艾叶和薄荷芳香水 5 小时,将收
集到的约 300ml 芳香水备用;过滤上述蒸馏母液,药渣与大黄等七味药加 14 倍
量水,进行 1.5 小时/次的煎取,共两次,过滤药液,将其减压浓缩至约 625ml,
再加入用温水融化的芒硝与枯矾,调节 PH 至 7.0,冷藏 8~16 小时,离心,取离
心液,最后加入冰片(95%乙醇溶解)和山梨酸 2g,加水调容量至 1000ml,混
匀,分装,即得。
2.黄甘控油洗剂治疗雄激素性秃发的临床观察
目的:探索黄甘控油洗剂在对轻度 AGA(湿热证)脱发、敏感炎症等方面
的临床疗效性及安全性。
方法:将纳入的 72 例病例随机分为两组,治疗组用除湿固发汤和黄甘控油
洗剂治疗,对照组用除湿固发汤和空白洗剂治疗,治疗观察 3 月,每 3 周使用先
锋汇美 Eagle Eye 毛发检测仪对毛发密度、角质量等进行检测;采集两组患者第
0 和 12 周中医证候和主要伴随症状评分,最后将收集到的头皮镜资料、中医证
候评分、伴随症状评分等数据,运用 SPSS26.0 进行分析。
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结果:
(1).总有效率治疗组 87.5%,对照组 84.3%,两组总体疗效比较差异
无统计学意义(P>0.05)。
(2).中医证候积分,组内比较有差异(P<0.01),组间比较无差异(P>0.05),
故两组治疗改善中医证候疗效相当。
(3).主要伴随症状,两组治疗前与治疗后分别比较,在皮脂溢出、瘙痒、脱
发数量、头皮炎症、头屑及总积分差异显著(P<0.01);治疗后两组比较,在皮
脂溢出、脱发数量、头皮炎症、伴随症状积分方面有差异(P<0.05),治疗组在皮
脂溢出、脱发数量、头皮炎症、伴随症状积分方面改善优于对照组,两组在头屑、
瘙痒方面比较无差异(P>0.05)。
(4).两组在第 0、3、6、9、12周头皮镜数据比较,治疗后两组同时段组间
比较,毛发密度、毛囊单位、细毛数量、细毛比例在第 3、6、9、12周均有差异
(P<0.05);在角质量、毛发粗细方面无差异(P>0.05);敏感炎症在第 3周无差异
(P>0.05),在第 6、9、12周有差异(P<0.05)。
结论:两组治疗对轻度 AGA 湿热证均有较好的疗效,安全性较高。黄甘控
油洗剂外洗组在临床总有效率、改善脱发数量、头皮敏感炎症、头皮油脂溢出、
毛囊单位、毛发数量上优于对照组,黄甘控油洗剂在对轻度 AGA 湿热证的干预
中有正向辅助治疗作用。
关键词:黄甘控油洗剂;雄激素性秃发;临床观察;制剂工艺;水提正交试
验法;单因素试验法
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Abstract
Part1. Study on the Preparation Technology of
Huanggan Oil Control Lotion
Objective:
Study the preparation of Huanggan Oil Control Lotion, determine its extraction
and molding technology, and lay the foundation for the development of hospital
preparations.
Methods:
Taking the volatile oil yield as the evaluation index, the single-factor experiment
method was used to optimize the preparation process of the aromatic water of
Platycladus orientalis leaf, mugwort leaf and peppermint; the prince medicine of
Platycladus orientalis (quercetin), licorice (ammonium glycyrrhizinate, glycyrrhizin)
The content of Phellodendron chinense (berberine hydrochloride) and Cnidium
monnieri (osthole) and the dry ointment rate are used as comprehensive evaluation
indicators. The orthogonal experiment method is used to determine the optimal water
extraction process; the content of the above indicators such as quercetin, Clarity and
microbial limit are the evaluation indicators, and the single factor experiment method
is used to optimize the concentration and purification process and the molding process.
Results:
Under 8 times the amount of water, extract the aroma water of Platycladus
orientalis, mugwort and mint with water for 5 hours, and collect about 300ml of
aromatic water for use; filter the above-mentioned distilled mother liquor, and add 14
times the amount of water to seven herbs such as medicinal residue and rhubarb.
Decoction for 1.5 hours/time, twice, filter the liquid, concentrate it under reduced
pressure to about 625ml, then add Glauber's salt and cumulon melted with warm water,
adjust the pH to 7.0, refrigerate for 8-16 hours, centrifuge, and take Centrifuge, finally
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add borneol (dissolved in 95% ethanol) and 2g of sorbic acid, add water to adjust the
volume to 1000ml, mix well, and dispense to get it.
Part2. Clinical Observation of Huanggan Control Oil
Lotion in Treati ng Androgenetic Alopecia
Objective:
Explore the clinical efficacy and safety of Huanggan Oil Control Lotion on mild
AGA (damp-heat syndrome) hair loss and sensitive inflammation.
Methods:
The 72 included cases were randomly divided into two groups. The treatment
group was treated with Chushi Gufa Decoction and Huanggan Control Oil Lotion, and
the control group was treated with Chushi Gufa Decoction and Blank Lotion. The
treatment was observed for 3 months and Xianfeng was used every 3 weeks. Huimei
Eagle Eye hair detector detects hair density, horn quality, etc.; collects the scores of
TCM syndromes and main accompanying symptoms in the 0 and 12 weeks of the two
groups of patients, and finally collects the collected scalp mirror, TCM syndrome scores,
and accompanying symptoms Data such as scoring are analyzed using SPSS26.0.
Results:
(1). The total effective rate was 87.5% in the treatment group and 84.3% in the
control group. There was no difference in overall efficacy between the two groups
(P>0.05).
(2). There is a difference in the scores of TCM syndromes within the group
(P<0.01), and there is no difference between the groups (P>0.05), so the two groups
have the same therapeutic effect in improving TCM syndromes.
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(3). The main accompanying symptoms were compared between the two groups
before and after treatment. There were significant differences in seborrhea, itching, hair
loss, scalp inflammation, dandruff, and total score (P<0.01); There were differences in
the scores of seborrhea, hair loss, scalp inflammation, and accompanying symptoms
(P<0.05). The treatment group was better than the control group in terms of seborrhea,
hair loss, scalp inflammation, and accompanying symptoms scores. The two groups
were better than the control group in terms of dandruff and itching. There was no
difference (P>0.05).
(4). Comparison of scalp microscopy data between the two groups at 0, 3, 6, 9,
and 12 weeks. After treatment, the two groups were compared at the same time. The
hair density, follicle unit, number of fine hairs, and fine hair ratio were at the 3rd, 6th,
and 6th week. There was a difference between 9 and 12 weeks (P<0.05); there was no
difference in horn quality and hair thickness (P>0.05); there was no difference in
sensitive inflammation at the 3rd week (P>0.05), at the 6, 9 and 12 weeks There is a
difference (P<0.05).
Conclusion:
The two treatments have good curative effect on mild AGA damp-heat syndrome,
and the safety is relatively high. The Huanggan Oil Control Lotion External Washing
Group is better than the control group in terms of total clinical effective rate,
improvement in the amount of hair loss, scalp sensitive inflammation, scalp oil
overflow, follicle units, and hair numbers. Huanggan Oil Control Lotion is effective in
treating mild AGA damp-heat syndrome There is a positive adjuvant therapy effect in
the intervention.
Key words:Huanggan Oil Control Lotion;Androgenetic Alopecia;Clinical
Observation;Preparation technology ;Orthogonal Test Method of Water Extraction;
Single factor test
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中英文缩略词表
英文缩写 英文全名 中文全名
AGA androgenic aloPecia 雄激素性秃发
5αR Steroid 5α-reductase 5α-还原酶
iNOS Nitric Oxide Synthase 一氧化氮合酶
COX-2 Cyclooxygenase 2 环氧化酶 2
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目录
中文摘要 .................................................................................................................. 1
1.黄甘控油洗剂制备工艺研究......................................................................... 1
2.黄甘控油洗剂治疗雄激素性秃发的临床观察.............................................. 1
Abstract..................................................................................................................... 3
Part1. Study on the Preparation Technology of Huanggan Oil Control Lotion .... 3
Part2. Clinical Observation of Huanggan Control Oil Lotion in Treating
Androgenetic Alopecia ...................................................................................... 4
中英文缩略词表....................................................................................................... 6
引言.........................................................................................................................11
一、黄甘控油洗剂制备工艺研究.......................................................................... 12
1.试剂试药与仪器 .......................................................................................... 12
1.1 试剂试药 ........................................................................................... 12
1.2 仪器................................................................................................... 13
2.四种中药饮片指标成分测定....................................................................... 14
3. 制备工艺研究............................................................................................ 15
3.1 芳香水制备工艺................................................................................ 15
3.2 水提正交试验................................................................................... 17
3.3 浓缩、纯化及 PH 值考察 ................................................................ 24
3.4 成型工艺研究 ................................................................................... 26
4.小结 ............................................................................................................. 27
5.讨论 ............................................................................................................. 27
5.1 质量控制指标成分的选择 ................................................................ 27
5.2 剂型的选择 ....................................................................................... 27
5.3 正交试验的选择................................................................................ 28
二、黄甘控油洗剂治疗雄激素性秃发的临床观察............................................... 29
1.研究目的...................................................................................................... 29
2.研究对象...................................................................................................... 29
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2.1 研究对象来源 ................................................................................... 29
2.2 诊断标准 ........................................................................................... 29
2.3 纳入标准 ........................................................................................... 30
2.4 排除标准 ........................................................................................... 30
2.5 剔除标准 ........................................................................................... 31
2.6 脱落标准 ........................................................................................... 31
3.研究设计...................................................................................................... 32
3.1 研究样本量 ....................................................................................... 32
3.2 研究分组 ........................................................................................... 32
3.3 治疗方案 ........................................................................................... 32
3.4 治疗调护 ........................................................................................... 33
3.5 观察周期及指标................................................................................ 34
3.6 技术路线图 ....................................................................................... 38
3.7 疗效判定标准 ................................................................................... 39
3.8 统计学方法 ....................................................................................... 39
4.研究结果...................................................................................................... 39
4.1 受试者入组情况................................................................................ 39
4.2 基线分析 ........................................................................................... 40
4.3 治疗后结果 ....................................................................................... 43
4.4 不良反应结果 ................................................................................... 57
4.5 脱离病例分析 ................................................................................... 57
讨论........................................................................................................................ 58
1.中医药外治脱发溯源................................................................................... 58
2.中药治疗雄激素性秃发的现代认识 ........................................................... 58
3.选择中药洗剂的原因及优势....................................................................... 59
4. 黄甘控油洗剂处方分析............................................................................. 59
4.1 处方来源及命名................................................................................ 59
4.2 组方分析 ........................................................................................... 60
4.3 处方中药物的药效作用.................................................................... 61
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5.导师治疗雄激素性秃发经验浅析 ............................................................... 64
6.除湿固发汤方义浅析................................................................................... 64
7.研究治疗结果探讨 ...................................................................................... 65
7.1 总疗效相当 ....................................................................................... 65
7.2 口服中药治疗作用一致.................................................................... 65
7.3 主要伴随症状差异探讨.................................................................... 66
7.4 皮肤镜指标分析................................................................................ 66
8.黄甘控油洗剂作用机制探讨....................................................................... 66
不足与展望 ............................................................................................................ 68
致谢........................................................................................................................ 70
参考文献 ................................................................................................................ 71
三、综述 ................................................................................................................ 77
1.雄激素性秃发的中医研究........................................................................... 77
1.1 中医病名溯源 ................................................................................... 77
1.2 病因病机 ........................................................................................... 77
2.雄激素性秃发的西医研究进展................................................................... 81
2.1 病因................................................................................................... 81
2.2 发病机制 ........................................................................................... 81
2.3 治疗进展 ........................................................................................... 83
参考文献 ................................................................................................................ 84
附录 1: HPLC 色谱图......................................................................................... 86
附录 2:随机数字表.............................................................................................. 88
附录 3:基本情况表.............................................................................................. 89
附录 4:知情同意书.............................................................................................. 90
附录 5:客观指标记录表 ...................................................................................... 91
附录 6:中医症候积分 .......................................................................................... 92
附录 7:主要伴随症状评分表............................................................................... 93
附录 8:不良反应表.............................................................................................. 94
研究生期间发表的论文 ......................................................................................... 96
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申明及授权书......................................................................................................... 97
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引言
雄激素性秃发(androgenic aloPecia,AGA,)又称为雄激素性脱发、脂溢性
脱发、弥漫性脱发,是以额、顶、颞部毛发进行性减少和毛囊的微小化为特点的
一种非瘢痕性脱发。[1]据 2010 年一项我国 AGA 流行病学调查数据显示,在我国
AGA 患病率,男性约为 21.3%,女性约为 6.0%。[2]据国家卫健委 2019 年脱发人
群调查数据,我国 2.5 亿人有脱发困扰,并且脱发发病趋于年轻化,其中 80 后
和 90 后约占 74.6%[3]。AGA 是脱发疾病中的最常见病,本病患者除有毛发脱落、
毛发变细、毛发稀少等临床表现外,常伴有头皮油脂增多、头皮屑、头皮瘙痒、
毛囊炎等症状,严重影响美观,成为困扰现代人的常见损容性疾病。随着国民生
活水平的提高和人们对外在形象的关注度以及对颜值的高要求,雄激素性秃发受
到越来越多的重视。
AGA 的治疗西医主要通过系统治疗、局部治疗、手术治疗三种方式,系统
治疗存在内分泌激素紊乱、性欲减退等副作用,局部治疗存在停药后复发、使用
周期长等问题,手术治疗存在费用高昂、术后恢复期长等问题,故中医药简便廉
效的治疗方式受到了患者青睐。中医通过整体辨证与局部辨证相结合的方式来看
待雄激素性秃发,在四诊合参、辨证论治的前提下,针对患者具体的病症表现遣
方用药,以达到较为理想的治疗结果。当前,中医药治疗雄激素性秃发具有有效
性好,安全性高,稳定期长的优势。中医治疗本病的主要手段有内服中药、外用
中药以及针灸疗法。内服中药包括中药汤剂、丸剂、散剂等,通过整体调理脏腑
功能来发挥治疗作用,不良反应少,复发率较低。但 AGA 病程长,长时间口服
中药依从性差。此时,外用中药及其制剂(酊剂、膏剂、洗剂等)中的方便易用、
依从性好的优点就显露出来。
导师黄莺教授在多年临床外用经验发现以经方“大黄甘草汤”为基础的外用
药物可能在阻止湿热型雄激素性秃发的脱发进程方面有较好的干预作用,本课题
将在中医药理论指导下确定有效处方,运用现代中药提取和制剂技术将其制作成
使用简便、病人接受度高并能坚持使用,且副作用少的外用剂型“黄甘控油洗剂”,
并结合其临床使用特点对湿热型雄激素性秃发轻度患者进行临床观察,探索黄甘
控油洗剂的具体功效和安全性,为中药外用洗剂的进一步开发提供依据。
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一、黄甘控油洗剂制备工艺研究
1.试剂试药与仪器
1.1 试剂试药
1.1.1 中药饮片
表 1-1 中药饮片
名称 批号 来源
大黄 1810064
甘草 1809017
侧柏叶 1808061
蛇床子 1807019
黄柏 1809041
苦参 1808082 四川新荷花中药饮片股份有限公司
炒苍耳子 1809059
薄荷 1811082
艾叶 1807082
芒硝 1811005
枯矾 1808095
千里光 180121 四川省中药饮片有限责任公司
冰片 180604 四川青神康华制药有限公司
1.1.2 对照品及其他试剂试药
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表 1-2 对照品及其他试剂
名称 批号 纯度 来源
甘草酸铵 110731-201317 92.6% 甘草苷 111610-201607 93.1%
槲皮苷 11538-201606 90.6% 中国食品药品检定研究院
盐酸小檗碱 110713-201613 86.8% 蛇床子素 110822-201710 99.5%
甲醇(HPLC) 190056038 /
乙腈(HPLC) 190045057 /
甲醇(AR) 2019060507 /
95%乙醇(AR) 2019050804 / 美国天地公司
磷酸(AR) 2019010701 /
磷酸二氢钾(AR) 2019050406 /
冰醋酸(AR) 2019050408 /
无水乙醇(AR) 2019060301 / 西陇化工股份有限公司
十二烷基磺酸钠 ZK160401 / 上海伊卡生物技术有限公司
1.2 仪器
表 1-3 实验仪器
序号 仪器名称 配置 厂家
二极管阵列检测器(DAD): G1315A
恒温色谱柱(TCC): G1316A
1 HP1100 高效液相色谱仪 自动进样器(ALS):G1313A
四元泵(Quat Pump):G1311A
在线脱气机:G1322A 美国惠普公司
2 98-1-C 型数字控温电热套 / 天津市泰斯特仪器有限公司
3 DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅 / 天津市泰斯特仪器有限公司
4 RE-501 型旋转蒸发器 40W/50HZ 上海耀特仪器设备有限公司
5 LE204E 型电子天平 万分之一 梅特勒托利多仪器公司
6 BP-211D 型电子天平 十万分之一 赛多利斯科学仪器仪器公司
7 JJ600 型电子天平 百分之一,MAX=600g 常熟市双杰测试仪器厂
8 KH-250B 型号超声波清洗器 250W/40kHz 昆山禾创超声仪器公司
9 DHG-9245A 型电热鼓风干燥箱 2450W/50HZ 上海一恒科学仪器有限公司
10 冰箱 / 青岛海尔特种电冰柜有限公
司海尔制冷
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2.四种中药饮片指标成分测定
方中甘草、侧柏叶、黄柏为君药,蛇床子为臣药,参照 2015 年版《中国药
典》一部中相应饮片项下的含量测定方法对甘草酸铵、甘草苷、槲皮苷、盐酸
小檗碱、蛇床子素的含量进行检测,结果见表 1-4。
表 1-4 四种中药饮片含量测定结果
饮片名称 含量 检测方法
甘草酸铵:
色谱柱:岛津 Inertsil C18 250mm×4.6mm
甘草 16.630mg·g-1 流动相:乙腈-0.05%磷酸溶液梯度洗脱
流速:1m·min-1;柱温:30℃
甘草苷:5.596mg·g-1
检测波长:237nm;进样体积:10μL
侧柏叶 色谱柱:岛津 Inertsil C18 250mm×4.6mm
槲皮苷:
流动相:甲醇-0.01mol/L
磷酸二氢钾溶液-冰醋酸(40:60:1.5)
2.713mg·g-1
流速:1m·min-1;柱温:30℃
检测波长:254nm;进样体积:10μL
色谱柱:岛津 Inertsil C18 250mm×4.6mm
流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液(50:50)(每 盐酸小檗碱:
黄柏 44.564mg·g-1 100ml 加十二烷基磺酸钠 0.1g)
流速:1m·min-1;柱温:30℃
检测波长:265nm;进样体积:5μL
蛇床子素 蛇床子素:
14.876mg·g-1 色谱柱:岛津 Inertsil C18 250mm×4.6mm
流动相:乙腈-水(65:35)
流速:1m·min-1;柱温:30℃
检测波长:322nm;进样体积:10μL
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3. 制备工艺研究
3.1 芳香水制备工艺
3.1.1 吸水率测定
(1)按处方比例取甘草、侧柏叶等 10 味药材 3 份,重量分别为 185.42g、
185.23g、185.82g,用 1000ml 水浸泡,浸透后用过滤(100 目纱布),剩余滤液体
积依次为 707ml、710ml、718ml,平均吸水率为 155.5%,约为生药的 1.6 倍。
(2)按处方比例取侧柏叶、艾叶、薄荷各 3 份,分别为 55.01g、55.11g、
55.07g,加入 500ml 水浸泡,浸透后过滤(100 目纱布),剩余滤液体积依次为
397ml、399ml、403ml,平均吸水率为 182.2%,约为生药的 1.8 倍。
3.1.2 芳香水制备工艺的考察
采用水蒸汽蒸馏提取挥发油的方法,影响挥发油提取的主要因素有药材浸泡
与否、加水量、蒸馏时间,采用单因素试验,以挥发油得率为评价指标进行提取
工艺的研究。
(1)侧柏叶、艾叶、薄荷挥发油含量测定
按处方比例称取侧柏叶、艾叶、薄荷适量,混合粉碎(过三号筛),称取 110g,
加水 500ml,据《中国药典》2015 版通则 2204 乙法,测定挥发油含量,蒸馏提
取 7 小时,试验结果见表 1-5。
表 1-5 总挥发油量测定
时间(h) 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0
提取量(ml) 0.56 0.7 1.31 1.70 1.83 1.90 1.91 1.93
由表 1-5 可知,蒸馏提取 5h 后,挥发油量不再增加,侧柏叶、艾叶、薄荷
挥发油含量为 1.90%。
(2)浸泡与蒸馏时间对挥发油提取量的影响
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称取侧柏叶、艾叶、薄荷 2 份,各 110g,以是否浸泡(浸泡时间 24h)为
变量,两组均加入 10 倍水量,在相同条件下蒸馏提取 7h,每 1h 收集芳香水
50ml,再照挥发油测定法(甲苯法),试验结果见表 1-6。
表 1-6 浸泡对侧柏叶、艾叶、薄荷挥发油收量的影响
时间(h) 提取量
(ml) 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0
浸泡组 0.56 0.91 1.32 1.55 1.67 1.70 1.71 1.76
未浸泡组 0.51 0.71 1.28 1.52 1.61 1.68 1.72 1.73
由表 1-6 可知,侧柏叶、艾叶、薄荷浸泡与否对挥发油总收量影响不大,5
小时后两组收量差异不大。5 小时后浸泡组与未浸泡组累计收油量已达到 88%,
因此,为节能,缩短生产时间,提高效能,本制剂选择不浸泡药材,蒸馏时间为
5h。
(3)加水量对挥发油收量的影响
称取五份侧柏叶、艾叶、薄荷,各 110g,分别加入 6、8、10、12、14 倍水,
在相同条件下蒸馏提取 5 小时,每小时收集芳香水 50ml,再分别测定总挥发油
含量,结果见表 1-7。
表 1-7 加水量对侧柏叶、艾叶、薄荷挥发油收量的影响
加水量(倍) 6 8 10 12 14
挥发油量(ml) 1.56 1.68 1.68 1.70 1.75
由表 1-7 可知,加水量变化对挥发油收量影响差距不大,为方便实际操作,
拟定 8 倍水量。
侧柏叶、薄荷、艾叶芳香水制备工艺:加 8 倍量水,蒸馏提取 5 小时。
(4)侧柏叶、艾叶、薄荷芳香水制备工艺验证
称取侧柏叶、艾叶、薄荷 3 份,每份 220g,分别加入 8 倍水,在相同条件下
蒸馏提取 5 小时,收集 500ml 芳香水,再测定总挥发油含量,试验结果见表 1-
8。
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表 1-8 制备工艺验证
收油量(ml) RSD(%)
验证 1 1.66
验证 2 1.70
验证 3 1.65 1.58
平均值 1.67
由表 1-8 可知,该制备工艺可行。最终,确定加水 8 倍量,蒸馏提取 5 小时
为薄荷、侧柏叶、艾叶芳香水制备工艺。
3.2 水提正交试验
3.2. 1 水提 L9(34)正交因素-水平设计
本方源自于我院皮肤科的的临床经验方,前期以临方制剂形式在临床使用。
本次试验以临方制剂的配制工艺为实试验基础,采用 L9(34)正交试验,考察
在加水量,煎煮时间、提取次数等影响因素变化时甘草酸铵、甘草苷、盐酸小檗
碱、槲皮苷、蛇床子素的含量及出膏率变化情况,确定优选水提工艺。水提正交
设计见表 1-9。
表 1-9 水提 L9(34)正交因素-水平设计表
因素
水平 Y1 Y2 Y3 Y4
加水量(倍) 提取时间(min) 提取次数(次) 空白(误差)
1 8 30 2 /
2 11 60 3 /
3 14 90 4 /
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3.2.2 正交试验操作及结果分析
3.2.2.1 药液制备
按处方比例称取侧柏叶、大黄等中药饮片9 份(185g/份),按照水提L9(34)
正交因素-水平设计表(表1-9)进行操作,制得药液,滤过,滤液减压浓缩至约
200 ml,室温放冷,加水定容,于4~8℃冷藏存放备用。
3.2.2.2 含量测定
① 检测条件
仪器:HP 1100 高效液相色谱仪;
色谱柱:岛津Inertsil C18 250mm×4.6mm;
柱温:30℃;流速:1.0m·min-1;进样体积:5μL;检测波长:216nm
流动相:以乙腈为流动相A,0.2%磷酸为流动相B,按表1-10 进行梯度洗脱;
表 1-10 梯度洗脱表
时间(分钟) 乙腈(%) 0.1磷酸溶液(%)
0 10 90
8 20 80
30 30 70
40 50 50
45 50 20
55 50 20
② 混合对照品溶液制备
精密称取槲皮苷对照品4.59mg、蛇床子素对照品8.01mg、盐酸小檗碱对照
品 19.99mg、甘草酸铵对照品 4.98mg 和甘草苷对照品 7.62mg,置于 25ml 量瓶
中,加甲醇溶解,定容至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液。
③ 供试品溶液制备
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精密吸取 1-9 号正交试验水提药液各 5mL,加 80%浓度乙醇溶液到 23ml,
超声处理满 10min,在室温环境下放置,加甲醇溶液,摇匀之后用 0.45μm 微孔
滤膜(PTFE)过滤后取滤液。
④ 测定法
将对照品、供试品溶液精密吸取各 5μL,注入高效液相色谱仪后记录峰面积,
采取外标一点法来计算够 5 个待测成分的含量。
⑤ 线性范围考察
精密吸取上述②项下的混合对照品溶液 0.5μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL,
注入液相色谱仪,按拟定的色谱条件检测后记录峰面积,将进样量(X)作为横
坐标,峰面积(Y)作为纵坐标来绘制标准曲线,得到回归方程。回归方程结果
见表,回归曲线见图 1-1。结果表明,甘草苷在 0.1418~1.4179ug 范围内、甘草酸
铵在 0.0922~0.9223ug 范围内、槲皮苷在 0.08317~0.8317ug 范围内、盐酸小檗碱
在 0.3470~3.4703 范围内、蛇床子素在 0.1594~1.15940ug 范围内,线性关系良好。
结果见表 1-11、图 1-1。
表 1-11 线性范围考察表
成份 回归方程 进样量范围(μg) r
槲皮苷 Y=1542.3x-2.3268 0.08317~0.8317 1.000
蛇床子素 Y=2286x+0.0573 0.1594~1.15940 1.000
盐酸小檗碱 Y=1208.4x-5.0203 0.3470~3.4703 1.000
甘草酸铵 Y=2023x-0.7496 0.0922~0.9223 1.000
甘草苷 Y=1503.1x-2.3019 0.1418~1.4179 1.000
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槲皮苷标准曲线
1400.0
1200.0
1000.0 y = 1542.3x - 2.3268
 R² = 1
800.0
600.0
400.0
200.0
0.0
0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000
槲皮苷标准曲线 线性 (槲皮苷标准曲线)
蛇床子素标准曲线
4000.0
3500.0
3000.0
2500.0
2000.0
1500.0 y = 2286x + 0.0573
 R² = 1
1000.0
500.0
0.0
0.0000 0.5000 1.0000 1.5000 2.0000
蛇床子素标准曲线 线性 (蛇床子素标准曲线)
盐酸小檗碱标准曲线
4500.0
4000.0 y = 1208x - 5.0203 3500.0 R² = 1
3000.0 2500.0 2000.0 1500.0 1000.0
500.0
0.0
0.0000 0.5000 1.0000 1.5000 2.0000 2.5000 3.0000 3.5000 4.0000
盐酸小檗碱标准曲线 线性 (盐酸小檗碱标准曲线)
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甘草酸铵标准曲线
2000.0
1500.0 y = 2023.6x - 0.7496
 R² = 1
1000.0
500.0
0.0
0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000
甘草酸铵标准曲线 线性 (甘草酸铵标准曲线)
甘草苷标准曲线
2500.0
2000.0 y = 1503.1x - 2.3019
 R² = 1
1500.0
1000.0
500.0
0.0
0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 1.4000 1.6000
甘草苷标准曲线 线性 (甘草苷标准曲线)
图 1-1 标准曲线图
3.2.2.3 出膏率测定
精密吸取精密吸取 1-9 号正交试验水提药液各 15mL(V),置已干燥至恒重
的蒸发皿(M1)中,在水浴蒸干后,于 105℃烘箱中干燥 3 小时,置干燥器中冷却
30 分钟,迅速精密称定重量(M2),计算出膏率。
M2:浸膏+蒸发皿干燥 3 小时后重量(g)
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M1:空蒸发皿重量(g)
M:生药量(g)
V:取液量(mL)
V 总:药液总体积(ml)
3.2.2.4 水提 L9(34)正交试验结果
表 1-12 正交实验结果表(n=3)
含量(mg·ml-1)
试验
Y1 Y2 Y3 Y4 A
盐酸小檗碱 B
槲皮苷 C
甘草酸 D
甘草苷 E
蛇床子素 F
出膏率
(%) 综合
评分
因素
1 1 1 1 1 7.638 1.304 3.527 5.170 1.192 15.89 59.90
2 1 2 2 2 10.103 1.392 4.797 6.380 1.687 17.61 70.37
3 1 3 3 3 9.428 1.094 4.263 5.810 1.784 23.59 77.55
4 2 1 2 3 6.292 1.803 3.989 6.160 0.663 18.86 68.26
5 2 2 3 1 7.842 1.630 4.780 6.242 0.927 20.41 72.67
6 2 3 1 2 7.395 1.479 4.391 6.325 0.841 18.01 66.05
7 3 1 3 2 6.673 1.136 3.997 5.855 0.488 19.70 63.18
8 3 2 1 3 19.850 1.947 4.347 5.682 2.894 18.38 84.72
9 3 3 2 1 19.666 1.751 5.074 7.492 3.385 22.56 96.24
注:
综合评分=(A/Amax*15/185+(B/Bmax+(C+D)/(C+D)max+E/Emax)*30/185+F/Fmax*0.43)*100
3.2.2.5 正交试验结果分析
用 SPSS19 分析正交实验结果,结果如见下表 1-13 和 1-14。
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表 1-13 直观分析表
因素 Y1 Y2 Y3 Y4(空白)
K1 207.82 191.34 210.67 228.81
K2 206.98 227.76 234.87 199.60
K3 244.14 239.84 213.40 230.53
R 12.39 16.17 8.07 10.31
由直观分析可知,各因素对水提效率的影响为 Y2>Y1>Y3,提取时间优于加
水量优于提取次数。
表 1-14 方差分析表
方差来源 TSS 自由度 方差 F 值 Sig
A 300.08 2.00 150.04 1.49 P>0.05
B 424.95 2.00 212.48 2.11 P>0.05
C 117.12 2.00 58.56 0.58 P>0.05
D(误差) 201.43 2.00 100.71
注:F0.05(2.2)=19.00;F0.01(2.2)=99.00。
方差分析表明,加水量、提取时间、提取次数对实验结果(出膏率和含量)
影响不显著;再结合综合评分,确定:加入 14 倍量水,提取 2 次,煎煮 90 分钟
/次,为最佳水提工艺。
3.2.3 水提工艺验证
为验证拟定工艺的可行性,按照处方比例称取 3 份饮片,每份重量为 370g,
按照优选的水提工艺进行操作,减压浓缩制备成药液 500mL,并照拟定检测方法
测定盐酸小檗碱、槲皮苷、甘草酸、甘草苷、蛇床子素含量及出膏率,结果见表
1-15。
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表 1-15 水提工艺验证结果(n=3)
含量(mg·g-1)
批 出膏率
盐酸小檗
次 (%)
槲皮苷 甘草酸 甘草苷 蛇床子素 碱
1 19.785 1.977 4.367 5.682 2.876 18.89
2 20.022 1.966 4.432 5.579 2.885 18.93
3 19.873 2.005 4.398 5.697 2.889 18.79
均值 19.893 1.983 4.399 5.653 2.883 18.87
RSD(%) 0.60 1.01 0.74 1.14 0.23 0.38
由表 1-15 可知,3 批验证样品之间的 RSD 均小于 5%,表明拟定工艺是稳
定可行的。
3.3 浓缩、纯化及 PH 值考察
前期预实验表明,本品水提浓缩液静置后有明显沉淀,取上清液与芒硝、枯
矾溶液混合后沉淀生成明显,上调 PH 值 6~7 时沉淀量明显减少。
本制剂最终剂型为外用洗发剂,临床应用经验表明,单次用量 100ml 为最佳
剂量,本制剂临床的 3 日处方及用量为侧柏叶 30g、黄柏 15g、甘草 30g、蛇床
子 30g、千里光 15g、大黄 15g、苦参 15g、炒苍耳子 10g、艾叶 10g、薄荷 15g、
芒硝(Na2SO4.10H20)10g、枯矾(KAl(SO4)2·12H2O)5g、冰片 1.2g,共计植
物药饮片 185g、矿物药 16.2g。
“3.2.3”项的水提工艺验证将 370g 植物药经水提减压浓缩成 500ml,其浓
缩液的含量测定结果稳定,表明减压浓缩方式是可行的,同时水提浓缩药液体积
也符合最终制剂成品体积要求。
基于上述结果,本部分试验以盐酸小檗碱、槲皮苷、甘草酸、甘草苷、蛇床
子素含量及纯化后药液澄清度为评价指标,对芒硝与枯矾溶液加入方式、药液 PH
值及纯化工艺进行考察。
24
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3.3.1 试验方法与样品制备
(1)称取芒硝 2g 和枯矾 1g 溶于水,制成 10ml 溶液,加入水提验证药液 50ml,
混匀,调节 PH 至 7.0,离心(1000 转/min)处理 10 分钟,取离心上清液。
(2)称取芒硝 2g 和枯矾 1g 溶于水,制成 10ml 溶液,加入水提验证药液 50ml,
混匀,调节 PH 至 7.0,于 4-8℃冰箱冷藏 2h,取出离心(1000 转/min)处理 10
分钟,取离心上清液。
(3)称取芒硝 2g 和枯矾 1g 溶于水,制成 10ml 溶液,加入水提验证药液 50ml,
混匀,调节 PH 至 7.0,于 4-8℃冰箱冷藏 4h,取出离心(1000 转/min)处理 10
分钟,取离心上清液。
(4)称取芒硝 2g 和枯矾 1g 溶于水,制成 10ml 溶液,加入水提验证药液 50ml,
混匀,调节 PH 至 7.0,于 4-8℃冰箱冷藏 8h,取出离心(1000 转/min)处理 10
分钟,取离心上清液。
(5)称取芒硝 2g 和枯矾 1g 溶于水,制成 10ml 溶液,加入水提验证药液 50ml,
混匀,调节 PH 至 7.0,于 4-8℃冰箱冷藏 16h,取出离心(1000 转/min)处理 10
分钟,取离心上清液。
3.3.2 测定结果与分析
表 1-16 测定结果
含量(mg·g-1) 离心药液冷藏
盐酸小檗碱 槲皮苷 甘草酸 甘草苷 蛇床子素 24h 后澄清度
1 16.983 1.683 3.927 4.884 2.584 有少量沉淀
2 16.859 1.699 3.971 4.855 2.576 有少量沉淀
3 16.893 1.702 3.985 4.867 2.578 有少量沉淀
4 16.874 1.683 3.993 4.793 2.589 药液澄清,无明显沉淀
5 16.834 1.667 3.974 4.832 2.579 药液澄清,无明显沉淀
结果表明,将加入枯矾与芒硝的水提浓缩药液 PH 值调至 7.0,再冷藏 8-16
小时后离心得到的离心药液澄清度较好,符合制剂需求。
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3.4 成型工艺研究
3.4.1 制剂处方设计
本处方拟制成洗剂,考虑到本剂型的特点及临床需要,应对制剂的 pH 值、
防腐剂进行筛选。
(1)pH 值考察
已在 3.3 项下对药液 PH 进行了考察。
(2)防腐剂筛选
本制剂为液体制剂,洗剂的保存、储藏需要加入一定量的防腐剂来保证质量。
苯甲酸、尼泊金酯类、山梨酸是常用的液体制剂防腐剂。因苯甲酸有刺激性且最
佳防腐和抑菌 PH 在 4.0 以下,尼泊金酯类水溶性差,均不适用于本制剂。山梨
酸是国际粮农组织和卫生组织推荐的高效安全防腐保鲜剂,具有代谢迅速、易于
分解、体内无残留、高安全性的特点,防腐 PH 范围与本制剂适宜 PH 范围相接
近,可以满足黄甘控油洗剂防腐需要,故选择山梨酸作为黄甘控油洗剂的防腐剂。
对山梨酸的常用浓度剂量 0.15%~0.20%进行微生物考察,试验结果见表 1-17。
表 1-17 防腐剂筛选结果
名称 用量(%) 微生物检查
 0.15 合格
山梨酸
0.20 合格
结果表明:在 0.15%、0.20%两种用量下微生物检查均合格,考虑 0.20%的用
量效果更优于 0.15%,故山梨酸的防腐用量确定为 0.20%。
(3)确定的制剂处方
侧柏叶 75g 大黄 37.5g 甘草 75g 蛇床子 75g 千里光 37.5g
黄柏 37.5g 苦参 37.5g 炒苍耳子 25g 艾叶 25g 薄荷 37.5g
芒硝 25g 枯矾 12.5g 冰片 3g 山梨酸 2g 制成 1000ml
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4.小结
本制剂制备工艺如下:
以上十三味,在 8 倍水量下,水蒸馏提取侧柏叶、艾叶和薄荷芳香水 5 小
时,将收集到的约 300ml 芳香水备用;过滤上述蒸馏母液,药渣与大黄等七味药
加 14 倍量水,进行 1.5 小时/次的煎取,共提取两次,过滤药液,将其减压浓缩
至约 625ml,再加入用温水融化的芒硝与枯矾,调节 PH 至 7.0,冷藏 8~16 小时,
离心,取离心液,最后加入冰片(95%乙醇溶解)和山梨酸 2g,加水调容量至
1000ml,混匀,分装,即得黄甘控油洗剂。
5.讨论
5.1 质量控制指标成分的选择
中药复方制剂的药味多、成分复杂,功效发挥多依赖多元化成分的多靶点作
用,故制剂工艺的结果判定应有多种药效成分的提取效果共同决定。在侧柏叶的
化学成份中,经检测槲皮苷是侧柏叶水提液中含量最高的成分[4],故选择槲皮苷
作为指标成份。甘草的有效成份甘草酸铵和甘草苷,黄柏的有效成分盐酸小檗碱,
臣药蛇床子的有效成份蛇床子素,具有较好的抗炎抑菌效果且能溶于水、乙醇[5]
等溶剂中。此 5 种成份药效稳定,专属性强,故选槲皮苷、甘草酸铵、甘草苷、
盐酸小檗碱、蛇床子素为的检测指标。
5.2 剂型的选择
查阅相关的药理、质量标准控制等文献资料表明,方中药味活性成份以水溶
性为主,而处方的功效主适用于急性期皮损,临床急性期的皮损的外用制剂剂型
以溶液、洗剂为主,鉴于本处方的临床使用特点和临床便捷性以及药效成份的水
溶液稳定性,故将本制剂的剂型拟定为洗剂,这与前期的临床应用剂型一致。
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5.3 正交试验的选择
中药复方制剂成分复杂,有效成分含量低,要保证制剂的有效成分溶解度,
采取的分离提取方式十分重要。中药提取方式和提取溶液、提取次数等影响因素
的差异均会影响有效成份的提取率。因此,制剂工艺最佳提取工艺参数的确定,
除了观察单因素对提取工艺的影响还需综合各影响因素的交互作用。正交试验是
中药提取的最常用的方法,采用正交试验可以有效减少提取试验次数,确定试验
最佳工艺。